L'apertura di The Pre-Sequel inizia qualche tempo dopo gli eventi di Borderlands 2, e immediatamente dopo l'Episodio 3 del gioco successivo Tales from the Borderlands, sulla città volante Sanctuary, dove i tre ex Vault Hunters Lilith, Brick e Mordecai interrogano l'ex assassina di Atlas, Athena, dopo averla catturata. Athena racconta la sua storia, iniziando dopo la morte di General Knoxx, quando riceve un'offerta per andare a trovare un Vault sulla luna di Pandora, Elpis, da un programmatore di Hyperion di nome Jack. Si unisce agli altri Vault Hunters Claptrap, Nisha, Wilhelm, Timothy e Aurelia su una nave diretta verso la base lunare di Hyperion, Helios. Durante il viaggio, sono assaliti dalla Lost Legion, un esercito di ex marines Dahl guidati dal Colonnello Tungsteena Zarpedon, e atterrano sulla base lunare. Dopo essersi riuniti con Jack, cercano di utilizzare il sistema di difesa di Helios contro la Lost Legion, ma si rendono conto che c'è un segnale di disturbo proveniente da Elpis. Cercano di fuggire, ma vengono fermati da Zarpedon e da un misterioso guerriero alieno, quindi Jack resta indietro per respingerli e invia i Vault Hunters su Elpis tramite un razzo moonshot. Dopo l'atterraggio su Elpis, gli Vault Hunters sono aiutati da Janey Springs, una commerciante di rottami che li guida nella città del porto spaziale Concordia. Qui, i Hunters, su ordine di Jack, chiedono aiuto alla sua ex fidanzata Moxxi per trovare il segnale di disturbo. Dopo aver saccheggiato una vecchia stazione Dahl, scoprono che il segnale è stato predisposto dal Meriff, la persona responsabile di Concordia, nonché ex sottoposto di Hyperion di Jack. Mentre ciò accade, Zarpedon attiva l'arma principale di Helios, l'Eye of Helios, che spara un potente fascio sulla superficie di Elpis, dichiarando di voler distruggere la luna per impedire a Jack di aprire il Vault. Jack affronta e uccide il Meriff nel suo ufficio. Con Concordia assicurata, Jack e Moxxi guidano gli Vault Hunters alla prossima fase per riprendere Helios. Si infiltrano in una base della Lost Legion, gestita da due ufficiali Dahl, il Bosun e lo Skipper, in cerca di un'intelligenza artificiale militare, che Jack intende usare per costruire un esercito di robot. Dopo aver sconfitto il Bosun, viene rivelato che la Skipper, che si rinomina Felicity, è l'IA che stavano cercando. Gli Vault Hunters si recano presso un impianto di produzione robotica, dove Jack recluta l'aiuto di un altro scienziato di Hyperion chiamato Gladstone per costruire il suo esercito di robot. Gladstone suggerisce di utilizzare il suo robot prototipo, chiamato Constructor, che ha la capacità di costruire un numero infinito di robot. In un primo momento, Felicity accetta di aiutarli diventando l'IA del Constructor, ma vedendo la violenza che deve attraversare, inizia a vacillare. Dopo essere stata costretta nel robot Constructor, prende il controllo di esso e combatte contro gli Vault Hunters. Felicity viene sconfitta, e la sua personalità viene cancellata dal bot Constructor. Una volta ottenuto il suo esercito di robot, Jack e gli Vault Hunters si dirigono verso Helios, mentre chiedono l'aiuto di Moxxi e di due ex Vault Hunters, Roland e Lilith (che si trovavano su Elpis per una vacanza). Mentre si trova su Helios, Jack uccide crudelmente Gladstone e gli altri scienziati al suo servizio dopo aver sospettato che uno di loro fosse una spia della Lost Legion. Gli Vault Hunters sconfiggono Zarpedon e le sue forze, e procedono a riavviare l'Eye of Helios. Si scopre che Eye è in realtà l'occhio del Destroyer, il mostro rilasciato dal Vault di Pandora nel primo gioco, che Jack prese e trasformò in un'arma. Gli Vault Hunters iniettano slag (scarto di Eridium prodotto da Hyperion) nell'Eye, su indicazioni di Moxxi. Nel tentativo di riavviare, Moxxi, Roland e Lilith tradiscono Jack e distruggono l'Eye per impedirgli di ottenere il potere supremo. Alla ricerca di vendetta, Jack e gli Vault Hunters tornano su Elpis, dove scoprono che il Vault è già stato aperto, come menzionato da Zarpedon prima della sua morte. I Hunters affrontano diverse guardie del Vault e sconfiggono il guardiano supremo, l'Empyrean Sentinel, simile a una Deva. Con il guardiano morto, Jack entra nel Vault, ma non trova alcun oggetto di valore, se non un simbolo misterioso che fluttua in aria. Mentre interagisce con esso, il simbolo mostra a Jack una visione del Warrior. Tuttavia, è interrotto da Lilith, che esegue phasewalk davanti a lui e perfora il simbolo del Vault, bruciandolo sul volto di Jack e deturpandolo. Lei si teletrasporti via, lasciando un Jack ferito e impazzito, che giura vendetta su Lilith e su tutti i banditi di Pandora, ora intenzionato a risvegliare il Warrior per prendere il controllo del pianeta. Rendendo conto che l'eroe che una volta l'ha salvata su Helios non c'è più, Athena lascia l'impiego di Jack. Dopo aver finito di ascoltare la storia di Athena, Lilith ordina ai Crimson Raiders di giustiziarla, nonostante le proteste di Brick e Mordecai. Tuttavia, mentre sparano su di lei, Athena viene salvata dal guerriero alieno apparso su Helios con Zarpedon, rivelato essere uno dei leggendari Eridiani. L'Eridiano avverte gli Vault Hunters di una guerra imminente, e che avranno bisogno di tutti i Vault Hunters che riusciranno a reclutare. Durante i titoli di coda, vengono mostrate diverse scene che rivelano cosa sia successo agli Vault Hunters dopo aver aiutato Jack. Wilhelm e Nisha si uniscono a Jack nella sua ascesa al potere; Wilhelm viene ulteriormente trasformato in una macchina e distrugge l'insediamento di New Haven, mentre Nisha diventa lo sceriffo di Lynchwood e si mette con Jack, che procede a formare un esercito, Athena rifiuta i soldi dati da Jack e lascia Elpis, e Claptrap viene smontato e lasciato per morto da Jack a Windshear Waste. In una scena post-credit, Jack, ora noto con il nome Handsome Jack e con una maschera sintetica per nascondere le cicatrici sul volto, uccide il suo CEO, Harold Tassiter, e annuncia alla segretaria di Tassiter tramite l'interfono di averlo rimpiazzato come nuovo capo di Hyperion.