Un giorno, il Mushroom Kingdom fu invaso dai Koopa, una tribù di tartarughe capaci di usare una potente magia oscura. La loro magia fu usata per trasformare tutti i Mushroom People in oggetti inanimati come rocce, mattoni e persino piante di crine di cavallo, segnando così la rovina del regno. Solo Princess Toadstool può spezzare l'incantesimo e riportare in vita il suo popolo, ma lei è tenuta prigioniera dallo stesso King Koopa. Mario viene a conoscenza della situazione della principessa e parte per una missione attraverso 32 livelli per abbattere la Turtle Tribe e salvare il regno un tempo pacifico.